淋球菌对环丙沙星的耐药性及耐药机制的研究

中华皮肤科杂志2000年第33卷第4期

李珊山 刘鹤松 钟淑侠 张林 邢天蕴

关键词：淋球菌；环丙沙星

自80年代以来，喹诺酮类药物在无合并症淋病的治疗中起了重要作用。然而，近年来随着该药的广泛应用，淋球菌对其敏感性逐年降低。淋球菌对喹诺酮耐药性的产生主要与 gyrA基因点突变有关。为探讨淋球菌对环丙沙星的耐药机制，我们采用聚合酶链反应（ pCR）和限制性片段分析，对56株淋球菌分离株进行环丙沙星敏感性测定和gyrA点突变的检测，结果如下。

一、材料与方法

（一）菌株来源：56株淋球菌野生株取自1998～1999年我院性病门诊淋病患者。WHO参考株A、B、C、D、E和环丙沙星标准品由中国医学科学院皮肤病研究所提供。

（二）gyrA的QRDR基因扩增及限制酶酶切：取各淋球菌分离株1个菌落形成单位，加裂解液15μL，置65℃10min，95℃8min。15000r/min离心5min，上清液作为DNA模板。根据淋球菌gyrA的QRDR合成引物[12]，正向链为5′－CGCG aTGCACGAGCTAAAAA－3′，反向链为 5′－CCGTCTATCAGCACATAACGCATAG cGAAATTTTGCGCCATACGGACGATGGAG －3′，扩增片段长度为165bp，其中在第91位丝氨酸密码子（Ser－91）处有一HinfΙ酶切位点，而在95位天冬氨酸密码子（Asp－95）处无HinfΙ位点，反向链引物起始于Asp－95附近，通过划线碱基A的置换，在Asp－95处人工产生第2个HinfΙ酶切位点。

PCR总体积为50μL，含10×PCR缓冲液5μL，dNTPs200μmol/L，引物各0.2μmol/L，模板5μL，TaqDNA聚合酶1.5U。经94℃1min、52℃50s和72℃50s， 共35个循环。取PCR产物5μL，加HinfΙ5U，置37℃4h。酶切产物在3％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。

二、结果

56株淋球菌临床株及参考株经PCR扩增，均产生165bp片段。用HinfΙ酶切PCR产物，参考株产生96bp和54bp片段。3株临床株产生111bp和54bp片段，表明在Ser－91位点有突变，这3株菌的MIC值分别为0.0125、0.5和0.5μg/mL。其余53株均未被HinfΙ酶切，表明在Ser－91和 asp－95处均有突变。

三、讨论

据报道gyrA点突变，尤其是Ser－91和Asp－95密码子（相当于大肠杆菌的Ser－83和Asp－87）的改变与淋球菌对喹诺酮敏感性降低密切相关，因此分析gyrA氨基酸的改变对于明确喹诺酮耐药机制具有重要意义。然而，gyrA基因测序费时、昂贵，不适用于流行病学研究。由于Ser－91含有一个HinfⅠ位点故可用限制酶酶切检测其点突变但Asp－95不含有限制酶位点常规方法难以检测其突变本研究应用引物特异性限制位点修饰法在Asp－95处引入一个碱基置换产生一个人工的HinfⅠ位点使Ser－91和Asp－95的突变可以同时检测出来。56株淋球菌分离株在Ser－91处有突变，而95％的菌株在Ser－91和Asp－95处均有突变，表明Ser－91或Asp－95的氨基酸取代可能使菌株对氟喹诺酮的敏感性下降。仅在 ser－91位点突变的3个菌株MIC值不超过1μg/mL，提示单一位点突变多引起低度耐药，而在53个双位点突变的菌株中，只有4株MIC值≤0.5μg/mL，其余均≥1μg/mL，且MIC≥4μ g/mL的菌株占77％，提示双位点突变多引起高度耐药。因此，筛查gyrA点突变对于预测喹诺酮治疗淋病的效果可能具有一定的临床意义。

作者单位：李珊山（130021长春，白求恩医科大学第一临床学院皮肤科)

刘鹤松（130021长春，白求恩医科大学第一临床学院皮肤科)

钟淑侠（130021长春，白求恩医科大学第一临床学院皮肤科)

张林（130021长春，白求恩医科大学第一临床学院皮肤科)

邢天蕴（130021长春，白求恩医科大学第一临床学院皮肤科）

参考文献

［1］Deguchi T Yasuda M Nakano M et al. Rapid detection of point mutations of the Neisseria gonorrhoeae gyrA gene associated with decreased susceptibilities to quinolones. J Clin microbiol199634:2255－ 2258.

［2］Deguchi T Yasuda M Asano M et al.DNA gyrase mutations in quinolone－ resistant clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents chemother 199539:561－ 563.